目的：建立高效液相色谱法的标准操作规程，保证正确操作。 范围：本标准适用于高效液相色谱法的操作。 责任者：QC主任，设备使用人员。 规程： 依据：《中华人民共和国药典》2000年版二部。 1 ?定义及概述： 1.1高效液相色谱法是一种现代液体色谱法,其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱留或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 1.2高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理机组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外一可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2. 高效液相色谱仪的使用要求：
2.1按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2,仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。 3. 操作前的准备： 3.1流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。对规定PH值的流动相，应使用精密PH计进行调节。配制好的流动相应通过0.45a m。适宜的滤膜滤过，用前脱气。应配制足量的流动相及时待用。 3.2供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配制成供试溶液。定量测定时, 对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45a m适宜的滤膜滤过。必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。 3.3检查上次使用记录和仪器状态:检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的PH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。 4操作： 4.1泵的操作； 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml,设置高流速（9ml/min）或用冲洗键PURGE进行充泵排气，观察出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止（STOP冲洗，关闭排放阀。 4.1.3将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示 应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏。初始平衡时间一般约需30分钟，如为梯度洗脱，应在程序器上设置梯度状态，用初始化比例的流动相对色谱柱进行平衡。 4.2紫外可见光检测器和色谱数据处理机的操作。 4.2.1开启检测器电源开关，选择光源（氘灯或钨灯），选定检测波长，
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC 主要内容包括： 1.高效液相色谱法（HPLC）的概述 2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼） 3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类 4. 液相色谱的适用性 5.应用 高效液相色谱法（HPLC）的概述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。 由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有5 0种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。 目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）为最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相
的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。 在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。 系统组成： （一）高压输液系统 由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。 1.贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。2.流动相 流动相常用甲醇-水或乙腈－水为底剂的溶剂系统。 流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。 3.高压输液泵 是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。 （二）进样系统 常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（L OAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。 （三）色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅
高效液相色谱法（HPLC） 一、方法原理 1、液相色谱法概述 高效液相色谱分析法
其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构 2、高效液相色谱法的特点（HPLC） 与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分
配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。 由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。 特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。 高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。 高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。 如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。 3、高效液相色谱法的固定相和流动相 （1）固定相 表面多孔型和全多孔型两大类。 （2）流动相（淋洗液） 流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。 从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求： ①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。 ②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱 性能的改变。 ③与所用的检测器相匹配。 ④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏 度。 ⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱 效）和适当低的沸点。
高效液相色谱法概述 摘要：本文概述了高效液相色谱的产生、发展，分类、应用、存在问题及发展前景。 关键词：高翔液相色谱、分类、应用 高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC) 是利用高压输液泵驱使流动相通过装填固定相的色谱柱，按照固液相之间的分配机制对混合物进行分离的方法。 一、高效液相色谱的产生及发展 在过去三十多年里, HPLC 已经成为一项在化学科学中最有优势的仪器分析方法之一, 1994年, HPLC 的市场销售量是14亿美元, 就是一个较好的证据。现在, HPLC 几乎能够分析所有的有机、高分子及生物试样。、 1941年, 马丁( Matin) 和辛格( Synge) 用一根装满硅胶微粒的色谱柱, 成功地完成了乙酰化氨基酸混合物的分离, 建立了液液分配色谱方法, 他们也因此获得了1952年诺贝尔化学奖。从此开启了色谱技术的发展，紧接其后的塔板理论、速率理论的建立，使得色谱技术和理论得到了迅速的发展。 HPLC 的第一个雏形是由斯坦因( Stein) 和莫尔( Moo re) 于1958年发展起来的氨基酸分析仪( AAA) , 这种仪器能够进行自动分离和蛋白质水解产物的分析, 由于这种研究的重要性, 别的研究者也被吸引来进行这一方面的重要课题的研究, 最终直接促成了HPLC 方法的建立。在此期间, 哈密顿( Hamiton) 在柱效率和选择性方面的成就而使得他的工作特别有价值。在六十年代早期的相关进展是莫尔( Moo re) 发展起来的凝胶渗透色谱( GPC) 。不久以后, 华特斯(Waters) 有限公司制造了商业GPC 仪, 这种仪器经过微小的改进之后可用于HPLC 分离。在1968～1971年间, 推出了第一台普遍适用的HPLC 商用系统。1971年以后, 对映体( 手性异构体) 和大生物分子如蛋白质的HPLC 分离逐步建立起
超高效液相色谱原理：分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、 压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数，凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。 在条件一定，样品浓度很低时时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。 超高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。 超高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。 高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用，流出组分易收集等优点，因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。 超高效液相色谱主要类型: 1.液液分配色谱分离原理：分配色谱法的原理与液液萃取相同，都是分配定律。 2.液固吸附色谱分离原理：液固色谱是基于各组分吸附能力的差异进行混合物分离的，其固定相是固体吸附剂。 3.键合相色谱分离原理：正键合相色谱分离远离：使用的是极性键和固定性，溶质在此类固定相上的分离机理属于分配色谱。 畜禽中瘦肉精分析 瘦肉精是盐酸克伦特罗的俗称，将其添加到饲料中可使动物生长速率、饲料转化率和胴体的瘦肉率提高10%以上,并降低其脂肪含量。长期使用会使该药蓄积在动物的组织中,造成组织中残留药物的浓度很高,人食用这种组织后15min~6h就可出现中毒症状。气相色谱技术可用于动物毛发、尿液及组织中盐酸克伦特罗的定性定量分析。样品从预处理到得出结果需要2天时间,检测下限为0.5μg/kg。 色谱技术的不断发展，以及高科技的应用，气相色谱技术将越来越完善。因其特别适用于气体混合物或易挥发性的液体或固体检测,即便对于很复杂的混合物,其分离时间也很短。其高分辨率、分析迅速和检测灵敏等显著优点使之成为每个分析检测实验室已采用的常规检测方法。因大多数食品中对人体有毒有害物质的组分复杂且是易挥发的有机化合物,所以,气相色谱技术在食品安全检测中有着非常广泛的应用前景。 气相色谱法是以惰性气体(N2或He)为载体将样品带入气相色谱仪进行分析的色谱法,而利用气相色谱仪对气体或液体样品进行组分分析的技术被称之为气相色谱技术。它特别适用于气体混合物或易挥发性的液体或固体检测,即便对于很复
UPLC（超高效液相色谱）技术 蒋娴丽 3031901045 在1996年，Waters公司推出Alliance HPLC时的主要目标是提高液相色谱的“精度”。当时多数公司都认为HPLC技术已经发展到极致了、而同时用户对性能没有更高的需求，因此HPLC的目标应该是降低成本、走向更低的价格以获得更广泛的应用。针对这样的观念，Waters公司提出：HPLC的技术没有到达极限，用户对HPLC有更高的要求，HPLC精度的提高对更好、更可靠的结果有极大的益处，对法规的遵从也是一个极大的促进。 站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的需求。首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成，例如代谢组学分析；其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在与MS及MS/MS 等检测技术联用时，对连接的质量提出了更高的要求。简而言之，我们需要“更快地得到更好的结果”。 今天我们发现，随着科学技术的进步，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角度的改进已经不行。这就需要同时从科学与技术的角度出发，或者说从理论高度对液相色谱重新认识。因此UPLC（超高效液相色谱）概念的提出也就十分自然。简而言之，UPLC是用HPLC的极限作为自己的起点。 理论基础 早在1956年，J.J van Deemter就发表了他著名的理论：van Deemter曲线及其方程式。最早这个理论是用在气相色谱上的，但是后来出现的液相色谱上也能应用这个理论。Waters 公司引入UPLC的概念就是由研究这个著名的方程式开始。 首先探讨一下这个著名的方程式。如果只关心理论塔板高度（H）与流速（线速度；u）及填料颗粒度（dp）之间的关系，就可以把该方程式作如下的简化： H=a(dp)+b/u+c(dp)2u 其中，A项代表了颗粒度和柱床填装的优良程度；B项代表了轴向扩散；而C项则代表了传质。从不同颗粒度的曲线中我们可以看到图1所示的现象：
高效液相色谱原理 DHPLC变性高效液相色谱技术是近年来发展起来的一项新的分析技术，它是分离核苷酸片段及分析检测已知未知基因突变和SNP的最佳技术平台，其核心技术采用Transgenomic公司专利技术的DNA SepCartridge分离柱。DHPLC能够分析检测已知未知突变和SNP，技术关键是依靠这样专利技术的分离系统，在专利技术的DNA SepCartridge分离柱中的基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）交联聚合物微球体，固定相为碳-18烷烃链，PS-DVB微球体与碳-18烷烃链之间形成碳碳共价键共同组成柱填料，填料是电中性、疏水性的，不易与核酸发生反应。三乙基铵醋酸盐（TEAA）是一种离子对试剂，离子对试剂既是疏水性的又带正电荷，既能与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应，同时TEAA的疏水基团又与固定相碳-18链的疏水基团发生反应。这种离子对试剂是连接核酸和柱基质之间的桥梁，因此，它作为“桥分子”使DNA片段吸附在固定相上面。通过改变流动相中乙氰及离子对试剂的浓度实现DNA片段的分离。
WAVE? DHPLC分离系统的三种操作模式： WAVE?系统是一套经济、高效及多用途的仪器。标准WAVE系统提供可选择的冷却设备、双板自动进样器、柱箱、紫外检测器和分离柱组成。这套系统可在同一分析标准下实现三种模式的运行。将标准WAVE系统加工和升级可以进一步提升系统的可用性。 执行模式温度应用分离基础 非变性 50℃测量双螺旋DNA的大小（小于2000bp）依赖大小 PCR质量检测及纯化依赖序列定量分析
部分变性 52-75℃变性检测依赖大小 （平均范围）单核酸多态性检测依赖序列完全变性 75-80℃测量双螺旋DNA大小（小于2000bp）依赖大小 （平均范围） DNA分析（DNA SepR柱）依赖序列 寡核苷酸质量（DNA SepR柱和OLIGO SepR柱）和纯度分析（片段收集器） 大量纯化需要OLIGOSepPrep TM HC柱 非变性条件：依赖分子量的分离
高效液相色谱原理 1、概述 在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。 气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。 2、液相色谱流程图 3、原理 液相色谱根据不同的种类其原理也不相同，但是其大致过程不外乎根据不同化学物质的性质不同，把这些物质用色谱柱的方式分离再进行定性定量分析的过程。下表主要为液相色谱的种类及其原理和相对应的应用。
4、关于HPLC软件 高效液相色谱软件在数据处理方面是以时间为横坐标，以探测器探测的信号的强度为纵坐标形成一系列谱图。 高效液相色谱研发的难点不在软件，而在于电气电路控制系统的开发。 5、HPLC在不同领域的主要应用 HPLC几乎在所有学科领域都有广泛应用，可以用于绝大多数物质成分的分离分析，它和气相色谱都是应用最广泛的仪器分析技术，HPLC在部分领域的主要分析对象物质列于下表： 总之：高效液相色谱是一种应用范围相当广泛的测试仪器，不同种类的高效液相色谱有不同的原理。但是其结构基本上一致，因此只要更换其中的部分零件，就可以用于测试不同的物质。高效液相色谱从1969年至今，其发展速度令人惊奇，其应用的范围也逐渐拓展。在中国的市场上，随着医药、化工、环保行业的发展，其市场前景不可限量。 张红平 2011年9月2日
